甲基化檢測是一種用于分析和檢測DNA甲基化狀態(tài)的技術(shù)手段，它在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，它發(fā)生在DNA分子的胞嘧啶堿基上，通過添加甲基基團(tuán)來調(diào)控基因的表達(dá)。甲基化通常發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位，形成5’-甲基胞嘧啶。這種修飾方式可以在不改變DNA序列的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。甲基化檢測就是通過各種技術(shù)手段來檢測和分析DNA分子上的甲基化狀態(tài)。

　　甲基化檢測的主要方法：

　　1、甲基化特異性的PCR

　　原理：用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，使所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　檢測：通過電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，則說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。

　　2、亞硫酸氫鹽測序法

　　原理：同樣使用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不變。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

　　方法：分為BSP-直接測序法和BSP-克隆測序法。后者將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序，以提高測序成功率。

　　3、高分辨率熔解曲線法

　　原理：在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若CpG島發(fā)生甲基化，則經(jīng)亞硫酸氫鹽處理和PCR擴(kuò)增后，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

　　檢測：通過監(jiān)測熔解溫度的變化來判斷CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。