免疫熒光實驗是一種基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的強(qiáng)大方法，主要原理是利用熒光標(biāo)記的抗體作為探針，定位和定性分析組織或細(xì)胞內(nèi)特定抗原。實驗中，先用已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。熒光素受到激光的激發(fā)照射會發(fā)出明亮的熒光（紅色或綠色），據(jù)此可以觀察到熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，并利用定量技術(shù)測定其含量。

　　免疫熒光實驗流程如下：

　　1、樣品準(zhǔn)備：

　　對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

　　2、固定：

　　根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min。

　　3、通透：

　　使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3×5 min。

　　4、封閉：

　　使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時間一般為30min。

　　5、一抗結(jié)合：

　　室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

　　6、二抗結(jié)合：

　　間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　7、封片及檢測：

　　滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。